ГОСТ 32635-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro (Переиздание)

     4 Описание метода

4.1 Материалы

Используют первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека [6, 20, 43, 44] и ряд клеточных линий грызунов, таких как СНО, V79, CHL/IU и L5178Y [19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 31]. Использование других клеточных линий и типов должно быть научно обосновано по критериям, описанным в разделе "Критерии приемлемости". Так как спонтанная частота микроядер влияет на чувствительность метода, рекомендуется использовать типы клеток с низкой, стабильной спонтанной частотой образования микроядер.

Лимфоциты человека следует отбирать у молодых (возраст приблизительно 18-35 лет), здоровых, некурящих индивидов, которые не имели недавнего контакта с генотоксическими химическими веществами и радиацией. Если клетки более чем одного донора объединяют для использования, число доноров должно быть указано. Частота микроядер возрастает с возрастом индивидов и этот тренд более заметен у женщин, чем у мужчин [45]. Это следует принимать во внимание при отборе доноров для объединения.

4.2 Среды и условия культивирования

Необходимо использовать соответствующую культуральную среду и условия инкубации (культуральная посуда, температура, концентрация и влажность). Перевиваемые клеточные линии и штаммы должны обычно проверяться на стабильность модального числа хромосом и отсутствие контаминации микоплазмой. Не следует использовать культуры, если выявлена контаминация микоплазмой или модальное число хромосом изменено. Должна быть известна нормальная продолжительность клеточного цикла для условий культивирования, используемых в лаборатории. Если используется метод цитокинетического блока, то концентрация ингибитора цитокинеза должна быть оптимизирована для каждого типа клеток и должно быть показано, что имеется хороший для анализа выход двуядерных клеток.

4.3 Подготовка культур
     

    4.3.1 Перевиваемые клеточные линии и штаммы

Клетки отбирают из исходных (сток) культур, высевают в культуральную среду в плотности, такой, чтобы культура не достигла слияния в монослое, а суспензионные культуры не достигли избыточной плотности, перед временем фиксации. Клетки инкубируют при 37°С.

4.3.2 Лимфоциты

Цельную кровь, обработанную антикоагулянтом (например, гепарином), или выделенные лимфоциты культивируют в присутствии митогена фитогемагглютинина (ФГА) перед воздействием исследуемого вещества и ЦХВ.

4.4 Метаболическая активация

При работе с клетками, у которых отсутствует адекватная эндогенная метаболическая система, следует использовать систему экзогенной метаболической активации. Наиболее часто используемая система включает кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9) печени грызунов, обработанных индукторами ферментов, такими как Arochlor 1254 [46, 47] или комбинацию фенобарбитала и -нафтофлавона [47, 48, 49, 50]. Последняя комбинация не противоречит Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязнениям [51] и, как было показано, так же эффективна как Arochlor 1254 по индукции оксигеназ смешанной функции [47, 48, 49, 50]. Обычно S9-фракцию используют в концентрации в диапазоне 1-10% от конечного объема среды. Условия системы метаболической активации зависят от класса тестируемого химического соединения. В некоторых случаях возможно проведение опыта с более чем одной концентрацией постмитохондриальной фракции.

Генетически инженерные клеточные линии, экспрессирующие специфические активирующие ферменты человека или грызунов, могут ограничить необходимость применения экзогенных систем метаболической активации и могут быть использованы в данной тест-системе. В этом случае выбор клеточных линий должен быть научно обоснован, например, пригодность оксидаз смешанной функции для метаболизма исследуемого вещества [52] и по ответу при тестировании известных кластогенов и анеугенов (смотри раздел "Критерии приемлемости"). Следует помнить, что тестируемое вещество может не метаболизироваться экспрессируемыми оксидазами смешанной функции. В этом случае отрицательный результат не указывает на то, что вещество не индуцирует микроядра.

4.4.1 Подготовка исследуемого вещества

Твердые вещества необходимо растворять в соответствующих растворителях или разбавителях и разводить перед обработкой клеток. Газообразные и летучие соединения следует тестировать при соответствующих модификациях стандартного протокола, таких как обработка в закупоренных сосудах [53, 54]. Свежие препараты должны использоваться до тех пор, пока не будут получены данные об их стабильности при соответствующих условиях хранения.

4.5 Условия тестирования

4.5.1 Растворитель/разбавитель

Растворитель/разбавитель не должен химически взаимодействовать с исследуемым веществом и не должен влиять на выживаемость клеток и активность S9 системы в используемых концентрациях. Если, помимо хорошо изученных (например, вода, культуральная среда, диметлсульфоксид), используется другой растворитель/разбавитель, его применение должно быть обосновано данными, показывающими его совместимость с исследуемым веществом и отсутствие у него генетической активности. Рекомендуется, если возможно, использовать в первую очередь водные растворы/суспензии.

4.5.2 Использование ЦХВ как блокатора цитокинеза

Одним из важнейших моментов проведения МЯТ является гарантия того, что анализируемые клетки прошли митоз во время обработки или в период инкубации после обработки, если его использовали в методике. ЦХВ - вещество, которое наиболее широко используется для блокирования цитокинеза, так как он подавляет сборку актина и таким образом препятствует разделению дочерних клеток после митоза, приводя к формированию двуядерных клеток [6, 55, 56]. Поэтому, подсчет микроядер может быть ограничен клетками, которые прошли митоз во время или после воздействия. Одновременно можно оценить действие вещества на кинетику пролиферации. ЦХВ следует использовать как блокатор цитокинеза в опытах с лимфоцитами человека, так как длительность клеточного цикла может варьировать между культурами и между донорами и не все лимфоциты будут отвечать на ФГА. Когда тестируют клеточные линии, другие методики используют, чтобы определить, прошли ли учитываемые клетки деление. Это рассмотрено ниже.

Необходимые концентрации ЦХВ следует определить в лаборатории для каждого типа клеток, чтобы достичь оптимальной частоты двуядерных клеток в контрольных культурах с растворителем/разбавителем. Обычно приемлемая концентрация ЦХВ находится в диапазоне между 3 и 6 мкг/мл.

4.5.3 Измерение клеточной пролиферации и цитотоксичности и выбор экспозиционных концентраций

При определении максимальной исследуемой концентрации вещества следует избегать концентраций, которые могут вызвать искусственный положительный ответ, вызывая сильную цитотоксичность, преципитацию в культуральной среде и заметное изменение pH и осмотической концентрации [40, 41, 42].