ГОСТ Р 56698-2015

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

Изучение репродуктивной токсичности на двух поколениях лабораторных животных

Methods of testing the chemicals of human hazard. Reproductive toxicity studies on two generations of laboratory animals

ОКС 07.080

        11.020

   11.120.01

Дата введения 2016-07-01

     

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 458 "Разработка, производство и контроль качества лекарственных средств" на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 458 "Разработка, производство и контроль качества лекарственных средств"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 11 ноября 2015 г. N 1759-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному документу ОЭСР Тест N 416:2001* "Исследование репродуктивной токсичности на двух поколениях" (OECD Test N 416:2001 "Two-Generation Reproduction Toxicity Study").

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе стандартов "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека"

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Введение

В Копенгагене в июне 1995 г., Рабочая группа ОЭСР по репродуктивной и эмбриональной токсичности обсуждала необходимость актуализации существующих руководств ОЭСР по репродуктивной и эмбриональной токсичности и разработке новых руководств по конечным точкам исследования. Рабочая группа рекомендовала пересмотр руководства по исследованию репродуктивной токсичности на двух поколениях, с учетом предложений, полученных из США и Германии. Рабочая группа достигла согласия по основным элементам пересмотра данного руководства.

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает порядок проведения исследований репродуктивной токсичности на двух поколениях лабораторных животных с целью предоставления основной информации в отношении воздействия исследуемого вещества на состояние и функционирование мужской и женской репродуктивных систем, включая функцию гонад, овариальный цикл, сексуальное поведение, зачатие, беременность, роды, лактацию и вскармливание, рост и развитие потомства, а также получения предварительных данных о влиянии исследуемого вещества на неонатальную заболеваемость и смертность, об эффекте на пренатальное и постнатальное развитие.

Настоящий стандарт предназначен для изучения роста и развития поколения F1, а также для оценки сохранности и работоспособности мужской и женской репродуктивных систем, роста и развития поколения F2, при этом дальнейшая информация по эмбриональной токсичности и функциональным нарушениям может быть получена или с помощью дополнительных элементов, которые могут быть включены в рассматриваемый план исследования с учетом руководств по эмбриональной токсичности и/или эмбриональной нейротоксичности, или при отдельном изучении данных параметров с учетом соответствующих руководств.

     2 Принципы исследования

Исследуемое вещество вводят в градуированных (пошагово увеличиваемых) дозах нескольким группам животных мужского и женского полов. Самцы поколения Р должны получать вещества в процессе роста и в течение одного полного цикла сперматогенеза (приблизительно 56 дней у мышей и 70 дней у крыс), чтобы обнаружить какой-либо нежелательный эффект на сперматогенез. Влияние на сперму определяется по ряду параметров спермы (например, морфология спермы и подвижности сперматозоидов) и с помощью тщательной гистопатологии препаратов ткани. Если данные по сперматогенезу получены в ранее проведенном исследовании с многократным введением вещества в течение достаточного периода времени, например при 90-дневном исследовании, то самцов поколения Р можно не включать в план данного исследования. Однако рекомендуется организовать хранение образцов или цифровых изображений спермы поколения Р для последующего возможного изучения. Самки поколения Р должны получать исследуемое вещество в процессе роста и на протяжении нескольких полных овариальных циклов, чтобы обнаружить какой-либо нежелательный эффект исследуемого вещества на нормальное течение овариального цикла. Исследуемое вещество вводится первому (родительскому, Р) поколению животных во время периода спаривания, в течение последующей беременности и на протяжении вскармливания их потомства, поколения F1. После вскармливания введение исследуемого вещества продолжается у животных поколения F1 в течение их роста до взросления, спаривания и получения поколения F2 и в период вскармливания поколения F2.

Наблюдение за животными и патологические исследования проводятся на всех животных с целью обнаружения токсических эффектов с основной целью - обнаружить влияние на состояние и функционирование мужской и женской репродуктивных систем, рост и развитие их потомков.

     3 Описание метода/подготовительных работ к проведению исследования

3.1 Выбор вида лабораторных животных

Наиболее подходящими для данного вида исследования являются крысы. Если используют другие виды лабораторных животных, то следует обосновать сделанный выбор и внести соответствующие изменения в план исследования. Не следует использовать в исследовании линии животных с низкой плодовитостью или широко подтвержденной высокой вероятностью врожденных пороков развития. На начало исследования вариабельность массы тела лабораторных животных должна быть минимальной и не превышать 20% средней массы тела животных обоих полов.

3.2 Условия содержания и кормления

Температура в помещении для содержания лабораторных животных должна составлять (22±3)°С. Хотя относительная влажность должна быть не менее 30% и желательно не превышать 70%, за исключением периодов мойки помещения, оптимальным режимом является 50%-60%. Освещение должно быть искусственным, с периодичностью света и темноты в 12 ч. Для кормления может быть использован стандартный лабораторный корм с неограниченной подачей питьевой воды. Выбор корма зависит от возможности его приемлемого смешивания с исследуемым веществом, если введение вещества осуществляется вместе с кормом.

Лабораторные животные могут содержаться в отдельных клетках небольшими группами одного пола. Процедуры спаривания следует проводить в клетках, позволяющих проведение данных процедур. После получения доказательства копуляции осемененные самки должны содержаться в индивидуальных клетках или клетках для беременных животных. Также животные могут содержаться небольшими группами и разделяться за 1-2 дня до родов. Лабораторные животные должны быть снабжены приемлемым и достаточным количеством материала для гнезда во время, предстоящее родам.

3.3 Подготовка лабораторных животных

В исследовании должны использоваться здоровые молодые особи, которые прошли период адаптации к лабораторным условиям в течение 5 дней и не подвергались ранее другим экспериментальным процедурам. Лабораторные животные должны быть описаны с указанием вида, линии, источника происхождения, пола, массы тела и/или возраста. Должны быть известны любые родственные отношения между включенными в исследование животными, чтобы исключить спаривание животных одного помета. Случайным образом животных распределяют в контрольную и испытуемую группы (рекомендуется метод стратификации по массе тела). Расположение клеток должно минимизировать какие-либо эффекты, связанные с их положением. Каждому животному должен быть присвоен уникальный идентификационный номер. Для животных поколения Р присвоение номера должно быть проведено до начала введения исследуемого вещества. Идентификацию животных поколения F1 проводят при вскармливании особей, предназначенных для последующего спаривания. Записи о происхождении щенков должны вестись для всех выбранных животных поколения F1. Дополнительно рекомендуется организовать индивидуальную идентификацию всех щенков непосредственно после рождения, если план исследования предусматривает индивидуальное взвешивание или проведение функциональных тестов.

На начало исследования возраст животных поколения Р должен составлять от 5 до 9 недель. По возможности животные во всех испытуемых группах должны быть одинакового возраста и массы тела.

     4 Процедура

4.1 Количество и пол животных

Все испытуемые группы и контрольная группа должны состоять из количества животных, достаточного для получения предпочтительно не менее 20 беременных самок, достигших родов или практически достигших родов. При испытании веществ, которые вызывают токсический эффект (то есть стерилизацию, избыточный токсический эффект при высокой дозе) это может быть недостижимо. Основная задача - получить достаточное количество беременных животных для обеспечения информативной (достоверной) оценки возможного влияния вещества на фертильность, беременности, послеродовое поведение и вскармливание, рост и развитие поколения F1 от зачатия до полового созревания и развитие их потомства (поколения F2) до окончания грудного вскармливания. Таким образом, невозможность получить желаемого количества беременных самок (то есть 20) не обязательно требует прекращения исследования и должна оцениваться индивидуально для каждого случая.

4.2 Подготовка вещества для введения

4.2.1 Рекомендуется вводить исследуемое вещество внутрь (с кормом, питьевой водой или через желудочный зонд), если другой путь введения (например, накожный или ингаляционный) не будет сочтен более приемлемым.

4.2.2 При необходимости исследуемое вещество растворяют или суспензируют в пригодном растворителе. Рекомендуется, если это возможно, использовать водные растворы/суспензии (первый выбор), затем определяется возможность использования масляных растворов/суспензий (например, кукурузное масло) и затем возможность приготовления раствора с использованием других растворителей. Стабильность вещества в растворителе должна быть подтверждена.

4.3 Дозирование

4.3.1 В план исследования должны быть включены не менее 3 доз и соответствующая контрольная группа. При отсутствии ограничения по физико-химическим параметрам или биологическим эффектам исследуемого вещества выбранная наивысшая доза должна вызывать токсическое действие, но не быть летальной или вызывать тяжелые страдания. В случае неожиданной гибели животных допустимым считают исследования с уровнем смертности первого поколения Р не более 10%. Последующие меньшие дозы определяются с целью продемонстрировать любые эффекты, связанные с дозой, и уровень "отсутствия токсических эффектов" (NOAEL) или дозы, близкие к пределу обнаружения, которые позволяют определить "нетоксичную" дозу. Обычно оптимальным считается 2-4-кратный интервал между используемыми более низкими дозами, и дополнительно для 4-й испытуемой группы рекомендуется использовать очень большой интервал (более, чем десятикратное уменьшение) между дозами. Для исследований, в которых вещество смешивают с кормом, интервал между дозами не должен превышать трехкратную дозу. Уровень доз следует выбирать с учетом имеющихся токсикологических данных, в частности, результатов исследований с многократным введением вещества. Любая имеющаяся информация о метаболизме и кинетике исследуемого вещества или родственных веществ должна быть учтена. Дополнительно такая информация будет также полезна для демонстрации адекватности выбранного режима дозирования.

4.3.2 Контрольная группа должна состоять из животных, не получающих исследуемое вещество или получающих только растворитель, если растворитель используется для введения исследуемого вещества. За исключением отсутствия введения исследуемого вещества, животные контрольной группы должны подвергаться всем тем же процедурам, что и животные опытных групп. При использовании растворителя контрольная группа должна получать растворитель в максимальном используемом объеме. Если исследуемое вещество вводится вместе с кормом и вызывает снижение потребления корма или его использования, то может потребоваться использование парной контрольной группы. Альтернативно, данные из контролируемых исследований, проведенных с целью исследования влияния снижения потребления пищи на репродуктивные параметры, могут быть использованы вместо соответствующей по потреблению пищи парной контрольной группы.

4.3.3 Должны быть учтены ниже приведенные параметры растворителя и других добавок: эффект на абсорбцию, распределение, метаболизм или задержку исследуемого вещества; влияние на химические параметры исследуемого вещества, приводящее к изменению его токсикологических характеристик; и влияние на потребление воды или пищи или статус "откормленности" животных.

4.4 Предельный тест

Если при введении внутрь в одной суточной дозе не менее 1000 мг на 1 кг массы тела с кормом или с водой, эквивалентного процента, при применении процедур, описанных в настоящем стандарте, не наблюдается токсического эффекта, или токсический эффект при этой дозе не ожидается, исходя из данных о структурно и/или метаболически родственных веществах, тогда полное исследование с использованием нескольких доз может быть нецелесообразно. Предельный тест применяется, за исключением случаев, когда действие у человека показывает необходимость использования более высокой дозы при введении внутрь. При использовании других путей введения, таких как ингаляционный или местное применение, часто максимальная достижимая концентрация зависит от физико-химических характеристик исследуемого вещества, таких как растворимость.

4.5 Введение доз

4.5.1 Животные должны получать исследуемое вещество в течение 7 дней в неделю. Предпочтительным является введение внутрь (корм, питьевая вода или желудочный зонд). Если используется другой путь введения, то это должно быть обосновано, и могут потребоваться соответствующие изменения. Все животные должны получать вещество одинаковым методом в течение приемлемой продолжительности эксперимента. При введении исследуемого вещества через желудочный зонд должна использоваться соответствующая канюля. Объем одномоментно вводимой жидкости не должен превышать 1 мл/100 г массы тела животного (0,4 мл/100 г массы тела - максимальный объем для кукурузного масла), за исключением водных растворов, при которых может вводиться 2 мл/100 г массы тела. За исключением раздражающих или коррозивных веществ, у которых, как правило, наблюдаются выраженные токсические эффекты при повышенных концентрациях, вариабельность вводимого объема должна быть минимальной путем корректировки концентраций, чтобы обеспечить постоянный объем для всех уровней доз. При использовании желудочного зонда щенки обычно получают исследуемую субстанцию опосредованно через молоко до момента прямого введения после прекращения грудного вскармливания. При введении вещества с кормом или водой щенки, как правило, будут получать дополнительно испытуемое вещество, когда они начнут кормиться самостоятельно в течение последней недели периода лактации.

4.5.2 При введении веществ с кормом или питьевой водой важно обеспечить отсутствие влияния количества исследуемого вещества на нормальное питание или водный баланс у животных. При введении вещества с кормом используется или постоянная концентрация вещества в корме (ррm), или постоянный уровень дозы в отношении с массой тела животных; использование других подходов должно быть указано. При введении исследуемого веществ через желудочный зонд вводимая доза должна вводиться в одинаковое время каждый день и корректироваться еженедельно для поддержания постоянного уровня дозы в отношении массы тела животного. При расчете дозы, вводимой через зонд, по отношению к массе тела животного, необходимо учитывать информацию о плацентарном распределении.

4.6 Экспериментальные графики

4.6.1 Суточное введение исследуемого вещества самкам и самцам первого поколения лабораторных животных Р начинается в возрасте от 5 до 9 недель. Суточное введение самкам и самцам поколения F1 начинается по прекращению грудного вскармливания; следует помнить, что в случае введения вещества с пищей или питьевой водой прямое воздействие на щенков поколения F1 уже происходит на протяжении периода лактации. Для животных обоих полов (поколения Р и F1) введение исследуемого вещества должно проводиться на протяжении не менее 10 недель до начала периода спаривания. Затем введение продолжается и у самцов, и у самок на протяжении двухнедельного периода спаривания. После этого, если самцы больше не требуются для оценки действия исследуемого вещества на репродуктивную систему, они подвергаются эвтаназии гуманным способом и подвергаются патологическому исследованию. Самкам поколения F вещество продолжают вводить на протяжении периода беременности и до окончания грудного вскармливания потомства поколения F1. Следует рассмотреть необходимости внесения изменения в график дозирования на основе имеющейся информации об исследуемом веществе, включая имеющиеся токсикологические данные, данные о метаболизме или биоаккумуляции вещества. Доза, вводимая каждому животному, как правило, основана на самом последнем определении массы тела животного. Однако корректировка дозы в течение последнего триместра беременности должна проводиться с осторожностью.

4.6.2 Наблюдение за животными поколений Р и F1 должно продолжаться вплоть до эвтаназии. Все животные этих поколений должны быть умерщвлены гуманным способом после прекращения периода наблюдения за влиянием исследуемого вещества на репродуктивную функцию. Животные поколения F1, не отобранные для спаривания, и все животные поколения F2 должны быть умерщвлены гуманным способом после окончания периода грудного вскармливания.

     5 Процедуры спаривания

5.1 Спаривание животных поколения Р

Для каждого спаривания пару самки и самца из одинаковой схемы дозирования (спаривание 1:1) помещают в одну клетку до достижения копуляции или содержат в течение 2 недель. Каждый день самок осматривают на наличие следов спермы или разрывов вагины. День беременности 0 определяют как день обнаружения разрывов вагины или следов спермы. Если спаривание прошло неудачно, может быть предпринята процедура повторного спаривания самок с выбранными самцами-производителями из той же группы. Спарившиеся пары должны быть четко идентифицированы в документации. Спаривания животных из одного помета следует избегать.

5.2 Спаривание животных поколения F1

5.2.1 Из животных поколения F1 выбирают минимум одного самца и одну самку из каждого помета на момент прекращения грудного вскармливания для спаривания с другими щенками из другого помета, но той же опытной группы, для получения потомства поколения F2. Выбор щенков из каждого помета должен осуществляться случайным образом при отсутствии значительных различий по массе тела или внешнему виду щенков в помете. При наличии таких различий следует отобрать наиболее репрезентативных особей из каждого помета. На практике наилучшим критерием отбора является масса тела, но допускается также проводить отбор по внешнему виду. Поколение F1 не следует спаривать до достижения полного полового созревания.

5.2.2 Пары без потомства следует оценить для определения истинных причин бесплодия. Оценку проводят с помощью таких процедур, как дополнительные возможности для спаривания с другими доказанными самцами-производителями или плодовитыми самками, микроскопией репродуктивных органов, изучением овариальных циклов или сперматогенеза.

5.3 Второе спаривание

В определенных случаях, например при связанном с действием исследуемого вещества нарушении размера помета или наблюдении непонятного эффекта при первом спаривании, рекомендуется провести второе спаривание животных поколения Р или F1 для получения второго помета. Для второго спаривания рекомендуется использовать самок или самцов, у которых не было помета с доказанными производителями противоположного пола. Если получение второго помета признано необходимым в любом из поколений, то животных следует спаривать приблизительно через неделю после прекращения грудного вскармливания последнего помета.

5.4 Размер помета

Допускается сохранить у животных весь помет и уход за детенышами до окончания грудного вскармливания. Стандартизация размера помета не является необходимой. При проведении стандартизации используемый метод должен быть подробно описан.

     6 Наблюдения

6.1 Клинические наблюдения

Общеклиническое наблюдение за животными проводится каждый день, и в случае использования желудочного зонда при выборе времени проведения процедуры должен учитываться ожидаемый пиковый период эффекта после введения исследуемого вещества. Следует регистрировать изменения поведенческих реакций, признаки тяжелых или затяжных родов и все проявления токсических эффектов. Дополнительно более детальный осмотр каждого животного должен проводиться не реже 1 раза в неделю и может быть совмещен с процедурой взвешивания. Дважды в день и один раз в день в выходные дни, если приемлемо, все животные должны быть проверены на наличие заболеваний или гибели.