МУК 3.1.7.3402-16 Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза

9.2. Методы выделения возбудителя и его растворимых антигенов

9.2.1. Бактериологический метод

Работа по выделению и дифференциации бруцелл из исследуемого материала должна проводиться в условиях, исключающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов окружающей среды, в строгом соответствии с требованиями нормативных правовых и методических документов по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).

Характерной особенностью представителей рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5-10 дней, а иногда через 20-30 дней после посева. При этом первые генерации культур B. abortus и B. ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислого газа (5-10%). B. abortus 5-го, 6-го и 7-го биоваров могут расти в обычных аэробных условиях.

Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя с добавлением сыворотки и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi-агар, среда "Д", печеночные и мясопептонные агары и бульоны (рН сред - 6,8-7,2). Рецепты приготовления сред приведены в прилож.2. В настоящее время в практике широко используется коммерческая среда для выделения бруцелл - эритрит агар. Данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя, однако при последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать.

Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды. Проверку сред осуществляют согласно нормативным правовым и методическим документам по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза.

9.2.1.1. Исследование крови и другого биологического материала.

Посевы крови рекомендуется делать во время лихорадочного состояния больного, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Однако не исключена возможность получения гемокультуры и при нормальной температуре больного. Кровь для посева следует брать до лечения антибиотиками. Посевы крови рекомендуется проводить во флаконы емкостью 100-200 мл, в которые наливают по 30-50 мл питательного агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы агар застыл на одной из сторон флакона. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25-30 мл предварительно простерилизованного бульона и выдерживают в термостате при температуре 37°C в течение 2-3 суток (агар с бульоном может быть использован не позднее 5-7 дней). Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании CO (5-10%), а другой - в обычных условиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду.

В последнее время в практике работы бактериологических лабораторий применяется питательная среда жидкая для транспортирования биоматериала и накопления бруцелл. Использование ее позволяет совместить этапы транспортирования крови в лабораторию и подращивания нативного материала. Исследуемая кровь в количестве 5 мл, взятая шприцем стерильно из локтевой вены больного, вносится той же иглой во флаконы со средой через предварительно обработанную спиртом резиновую пробку. Хранить засеянные флаконы до отправки можно в течение 2 недель в зависимости от конкретных условий: в термостате, при комнатной температуре или в холодильнике. В бактериологической лаборатории содержимое флакона высевают на плотные питательные среды или во флаконы для выращивания по методу Кастанеда, после чего один флакон помещают в термостат при температуре 37°C на 7-10 суток в условиях избыточного содержания CO, а другой - при обычных условиях. При появлении на поверхности агара колоний бруцелл, последние снимают петлей и пересевают на плотные питательные среды для дальнейшего изучения.

При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4-6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрильной температуре) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальные питательные среды для выделения бруцелл в L-форме (прилож.2).

Способ бактериологического посева материала для выделения L-культур идентичен методу выделения бактериальных гемокультур. Посевы выдерживаются в термостате не менее 35-40 дней.

Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала. Посевы производят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры в среду следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000. С этой целью также добавляют антибиотики, в частности полимиксин В - 3 мкг/мл и амфоглюкамин - 3 мкг/мл.

9.2.2. Биологический метод

Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой, и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале используются биопробные животные - морские свинки (массой 300-350 г) или белые мыши (массой 17-18 г). Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.

Вскрытие белых мышей проводится через 20-25 дней, морских свинок - через 30-35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации на наличие специфических антител. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей - лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для посева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга проводят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов берут "уколом" стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм с гладкой поверхностью и несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 ч в дезинфицирующий раствор (3%-й раствор перекиси водорода) или кипятят в воде 40 мин, после чего тщательно промывают, стерилизуют для последующего использования. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°C 20-25 дней. Просмотр посевов в пробирках с агаром и бульоном проводят каждые 3-4 дня, из помутневших бульонов делают высевы в пробирки со скошенным агаром.

Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при выявлении специфических антител в сыворотках крови животных в РА в титре не менее 1:20.

Для выделения бруцелл в L-форме морских свинок рекомендуется вскрывать на 7-е, 14-е и 30-е сутки после введения исследуемого материала, так как вероятность получения изолятов в L-форме на 7-е, 14-е сутки выше, чем на 30-е сутки.

9.2.3. Методы идентификации бруцелл

Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella используют следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, выявление родоспецифичных локусов методом ПЦР, ИФА.

Морфология колоний. Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком) с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют. В падающем свете белесоватые, в проходящем - янтарно-желтого цвета.

Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3-4 мм и больше, могут быть очень мелкие - точечные колонии диаметром 0,1-0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).

Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу, обычный световой микроскоп с объективом наименьшего увеличения.

Микроскопия окрашенных препаратов. При окраске по Граму бруцеллы окрашиваются в красный цвет (грамотрицательны). Окрашивание препаратов по способу Козловского: фиксированные препараты окрашивают 0,5%-м водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-м водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40-50 с. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина. Другие бактерии окрашиваются в зеленый цвет.

Проба со специфической сывороткой. Для предварительной, быстрой идентификации культуры ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю бруцеллезной поливалентной сыворотки, разведенной 1:25 0,9%-м раствором натрия хлорида, в которой эмульгируют одну петлю исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 мин) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных - суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной кроличьей сыворотки или 0,9%-м растворе натрия хлорида.

Люминесцентная микроскопия (см. раздел 9.5.2 "Метод флуоресцирующих антител (МФА)").

Полимеразная цепная реакция (см. раздел 9.5.6 "Полимеразная цепная реакция (ПЦР)").